一、mRNA治疗性肿瘤疫苗简介

在本文上篇，已经简要介绍了肿瘤疫苗的主要品类、治疗原理和在研管线，本篇将着重介绍mRNA技术路线的治疗性肿瘤疫苗。

总体来说，mRNA肿瘤疫苗和其他疫苗一样，在疫苗接种期间，裸露或载体负载的mRNA疫苗在抗原呈递细胞（APC）中有效表达肿瘤抗原，促进APC活化和先天/适应性免疫刺激。由于具有高效、安全、快速响应和生产成本低的优势，mRNA癌症疫苗是所有治疗性肿瘤疫苗技术路线中非常具有发展前景的。

然而，mRNA疫苗应用受到不稳定性、先天免疫原性和体内递送效率低的限制。目前已经研究了适当的mRNA结构修饰（如密码子优化、核苷酸修饰、自扩增mRNA等）和配制方法（脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物、肽等）以克服这些问题。

一旦克服了mRNA体内不稳定和免疫原性的问题，mRNA技术路线的优势则是其他技术路线无可比拟的：

1.mRNA疫苗允许同时传递涵盖各种TAA/TSA多种抗原，从而引起体液和细胞介导的免疫反应，增加克服疫苗耐药性的可能性。

2.与肽疫苗不同，核酸疫苗可以编码全长肿瘤抗原，使APC能够同时呈现或交叉递呈患者的特异性人类白细胞抗原（HLA）的I类和II类多个表位，因此，人类HLA类型的限制较少，更可能刺激更广泛的T细胞反应。

3.mRNA疫苗是非传染性的，在生产过程中没有蛋白质或病毒源性污染。

4.mRNA与DNA相比，作为疫苗的优势包括：

（1）mRNA可在分化和不分裂的细胞中翻译，而且RNA只需进入细胞质，然后一步转化为感兴趣的抗原，DNA需要进入细胞核，因此mRNA的效价比通常高于DNA疫苗。

（2）与DNA疫苗不同，mRNA疫苗不能整合到基因组序列中，因此不会在基因组插入额外的突变，在安全性上是大大优于DNA疫苗的。

到目前为止，已经超过20种基于mRNA的免疫疗法已进入临床试验，在实体瘤治疗中取得了一些有希望的结果，调整给药途径和多种mRNA疫苗与其他免疫治疗剂（例如检查点抑制剂，ICB）的共同递送进一步提高了宿主抗肿瘤免疫力并增加了根除肿瘤细胞的可能性。

随着最近美国FDA批准辉瑞BioNTech和Moderna的两种基于mRNA的疫苗用于COVID-19预防的紧急应用，mRNA疫苗领域的市场价值急剧上升，并将引起人们对癌症和传染病的广泛兴趣。

在本文中、下篇，将探讨mRNA疫苗开发的核心技术：

mRNA结构上进行的改进以提高稳定性和翻译效率

自扩增mRNA（SelfAmplicationmRNA，SAM）在癌症疫苗中的应用

用于mRNA治疗的递送载体LNP的基本原理

总结目前mRNA癌症疫苗的临床应用

二、基本的mRNA药理学、局限性和优势

mRNA是一种单链大分子，对应于细胞核中DNA的遗传序列，被核糖体读取并翻译成细胞质中的蛋白质。mRNA疫苗的基本原理是将编码一种或多种TAA或TSA转录物递送到宿主细胞（通常为APC）细胞质中以表达靶抗原。表达的TAA和TSA可以通过APC中的主要组织相容性复合物（MHC）呈递到APC的表面以激活抗肿瘤免疫性。mRNA疫苗可诱导抗体/B细胞介导的体液应答和CD4+T/CD8+细胞毒性T细胞应答，这有利于有效清除恶性细胞。另一方面，mRNA是非感染性和非整合性的，因此它是相当可耐受的并且没有遗传风险。

目前主要研究三种类型的mRNA作为癌症疫苗：

1.非复制性非修饰的mRNA，

2.非复制性修饰的mRNA

3.病毒衍生的自扩增mRNA（SelfAmplicationmRNA，SAM）

上述三种类型的mRNA通常使用体外转录（Invitrotranscription，IVT）合成方法实现mRNA的生产。该方法利用噬菌体RNA聚合酶，例如T3、T7或SP6RNA聚合酶和含有靶抗原序列的线性化DNA模板。IVT生产排除了细胞、病毒的使用及其相关的风险，因此比大规模灭活疫苗或蛋白质生产和纯化更简单、更快和更清洁。

如图1，常规的非复制IVT-mRNA的生产过程与成熟真核细胞的mRNA生成相类似，基本结构由编码靶抗原序列的开放阅读框（ORF）区域组成，其两端侧翼为5端引物（prime)和3非翻译区（UTR），并分别通过7-甲基高鸟嘌呤（m7G）5端cap和3端（polyA）尾进一步稳定，5端cap和3端polyA可以在IVT期间添加或在IVT之后酶促添加。

图1.常规mRNA结构示意图

相对的，SAM包含两个ORF，包括一个编码靶向抗原序列的ORF和另一个编码病毒复制机制的ORF，使其能够在细胞内进行持久的RNA扩增。

一旦非复制的mRNA或SAM被靶细胞内吞并转移到胞质溶胶中，它将被核糖体读取，进行翻译及修饰加工，最终产生正确折叠的功能性蛋白质。剩余的IVT-mRNA序列将通过正常的生理过程降解，降低代谢物毒性风险。

三、mRNA的免疫原性和癌症免疫治疗中的矛盾效应

先天免疫反应通常由宿主免疫系统通过模式识别受体（patternrecognitionreceptors，PRR）检测病原体相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpattern，PAMP）的外源motif来激活。

这些受体在APC中特别高表达，APC是mRNA癌症疫苗的主要靶细胞群。外源性IVT-mRNA先天具有免疫刺激性，它可以被多种细胞表面受体、endosome和胞质PRR识别。endosome内IVT-mRNA的识别主要由toll样受体（TrollLikeReceptor，TLR）TLR-7和TLR-8（一种类型的PRR），随后激活髓样分化标志物88（myeloiddifferentiationmarker88，MyD88）通路，介导1型干扰素（interferon，IFN-1）通路的激活和促炎细胞因子的分泌。

在胞质中，这些外源mRNA被其他PRR家族感知，包括视黄酸诱导基因-I样（retinoicacid-induciblegene-I-like(RIG-I-like)receptors，）受体、寡腺苷酸合成酶（oligoadenylatesynthetase，OAS）受体和RNA依赖性蛋白激酶（RNA-dependentproteinkinase，PKR）。这些PRR可以感知不同的RNA，包括双链RNA（dsRNA）和单链RNA（ssRNA），并且阻断mRNA的翻译。

多种PRR的激活和IFN-1的产生对于抗癌免疫疗法的潜在收益可能是矛盾的。在某些情况下，IFN-1通路激活驱动APC活化和成熟，促进抗原呈递，并引发强烈的适应性免疫应答。然而，RNA所引发的先天免疫感知可能与抗原表达的抑制有关，从而抑制免疫应答。具体而言，噬菌体RNA聚合酶在IVT期间产生不需要的dsRNA，可通过PKR、OAS、TLR-3、MDA-5（一种类型的RIG-I样受体）激活先天免疫。一旦PKR被激活，真核起始因子（eIF）-2可被磷酸化，阻断mRNA翻译。此外，dsRNA在与OAS结合后激活RNaseL，导致外源RNA降解。最终，dsRNA与MDA-5和TLR-3的结合可以激活IFN-1，引发其他几种抑制mRNA翻译的基因。除了dsRNA杂质之外，不正确设计的mRNA结构还可以激活PRR如MDA-5和PKR，从而降低乃至消除mRNA抗原表达。

IFN-1的激活所带来的相互矛盾的下游通路的影响不仅限于抗原的表达，而且还表现在CD8+?T细胞活化。简而言之，IFN-1对CD8+?T细胞活化可能取决于IFNAR信号传导和TCR信号传导之间的时机和动力学，从而可能进一步影响到mRNA癌症疫苗的给药途径。例如，一些研究表明，IFN-1可能促进CD8+T细胞对全身mRNA疫苗接种的反应。可能的机理是，静脉内（i.v.）递送mRNA（通常由阳离子脂质复合物递送）在脾DC中表达，其中抗原表达和呈递同时发生，TCR信号传导在IFNAR信号传导之前或与之一致。

相反，IFN-1可能潜在地干扰局部（I.d.或s.c.）mRNA疫苗接种，其中抗原表达在注射部位局部发生，但抗原呈递发生在次级淋巴器官中，IFNAR信号传导先于TCR信号传导。然而，这种IFNAR/TCR信号理论仍在争论中，因为其他研究小组观察到局部给予mRNA疫苗的相反效果。因此，需要调整mRNA产物的纯度、mRNA序列的修饰、递送系统的设计和给药途径以适当地激活先天免疫以启动适应性免疫应答，同时避免抑制抗原蛋白表达过度的毒性活化和免疫反应。

四、提高mRNA翻译效率和克服先天免疫原性的策略

01

5端cap优化

模拟真核mRNA的IVT-mRNA通常通过5，5-三磷酸桥将N7-甲基化鸟苷添加到第一个5核苷酸上，以在真核系统中有效的翻译。此5m7G顶端或m7Gppp-通常称为“Cap0”。5端cap募集真核翻译起始因子4E（eukaryotictranslationinitiationfactor4E，eIF4E）以促进核糖体识别和翻译起始。酶和化学合成均适用于mRNA5端加帽。

最广泛使用的体外翻译后加帽酶法是基于天花病毒加帽酶（VCE）的病毒加帽系统。VCE由2个亚基（D1和D12）组成。D1亚基具有三磷酸酶、鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性，所有这些对于添加完整的“Cap0”结构都是必不可少的，而D12在激活D1中起着必要的作用。病毒加帽系统提供接近%的加帽效率，但大规模加帽的RNA生产需要有效的VCE表达和纯化。

除了IVT酶促翻译后加帽方法之外，化学加帽方法是在IVT共转录的同时添加帽类似物。然而，在IVT（共转录过程）期间添加的常规帽类似物可能会反向掺入mRNA序列中。因此，大约三分之一的mRNA分子未正确甲基化，游离磷酸盐悬挂在5位置，导致下游mRNA翻译效率低下。为了防止反向掺入，已经开发了抗反向帽类似物（anti-reversecapanalogs，ARCA）。ARCA在C3位置（接近m7G）甲基化以确保在IVT期间仅在非甲基化鸟苷处添加核苷酸。ARCA加帽的mRNA增加并延长体外蛋白质表达。为了抑制相应mRNA的去帽和增加对eIF4E的结合亲和力，通过桥氧（例如（亚甲基双）膦酸酯和亚氨基二磷酸酯）或非桥氧（例如硫代磷酸酯和磷硒酸酯）在三磷酸键内进一步修饰ARCA。

ARCA加帽的局限性是：

(1）加帽效率相对较低（60-80%）;

(2）加帽后才形成Cap0结构;

(3）Cap在C3位置含有非天然的O甲基，可被识别为外源基序;

(4）mRNA转录本必须从鸟嘌呤（G）开始。

在IVT后可以酶促添加5cap以实现具有天然未修饰的cap结构的%封端效率。然而，该过程成本高昂并且存在批次间差异。

Tri-link公司的下一代共转录帽类似物CleanCap?,是在年开发的，以克服与ARCA相关的问题。CleanCap?利用引发Cap的三聚体产生天然的未修饰的封端结构，封端效率提高到近90–99%。

02

UTR的优化

UTR可以通过与RNA结合蛋白相互作用来影响mRNA降解速率和翻译效率。可以优化5UTR序列以增强mRNA的稳定性和翻译的准确性。首先，避免在5UTR中存在起始密码子（AUG）和非规范起始密码子（CUG），因为这些密码子可能会干扰开放阅读框（openreadingframe，ORF）的正常翻译过程。其次，避免存在高度稳定的二级结构，会阻碍核糖体募集和密码子识别。第三，可以引入较短的5UTR，因为先前的研究表明这种类型的5UTR更有利于mRNA翻译过程。最终，生物信息学工具可用于根据5UTR序列预测mRNA翻译效率。

来自非洲爪蟾或人类的α-球蛋白和β-球蛋白含有翻译和稳定性调节元件，通常用作IVT-mRNA的3UTR。为了进一步改善RNA稳定性，可以引入富含AU和GU的序列。此外，通过串联添加3UTR序列两次可以提高转录效率。总体而言，UTR性能取决于物种、细胞类型和细胞状态，需要了解靶细胞中的药理学，以便更好地设计治疗性mRNA疫苗的UTR。

03

ORF的密码子优化

ORF中鸟嘌呤G和胞嘧啶C含量的优化可用于调节翻译延伸率。减少尿苷U是另一种密码子优化策略，可以直接与增加的GC含量相关联。富含尿苷U的区域可被RIG-I识别，其活化可削弱蛋白质表达。此外，以在靶细胞中高度表达的蛋白质中天然存在的每个密码子的相同比例进行mRNA序列ORF密码子优化，或者使用在这些高度表达的蛋白质中常见的最佳密码子。另外，具有较高tRNA丰度的密码子通常用于替换ORF中的稀有密码子以提高翻译速率。最后，在ORF中应避免高度稳定的二级结构和发夹环结构。

然而，高翻译率并非全部有益，因为一些蛋白质需要低翻译率才能正确有效地折叠。因此，应仔细监测ORF中的密码子优化，以确保中等翻译率和高翻译准确性。Thess等人证明化学未修饰的经过密码子优化的mRNA完全适合用于mRNA治疗，蛋白质表达水平甚至高于化学修饰但没有密码子优化的mRNA，表明密码子优化在提高mRNA表达效率中的重要性。

04

3端polyA尾优化

3端polyA尾序列可以减缓RNA核酸外切酶的降解过程，提高RNA稳定性，提高翻译效率。合适长度的polyA尾是至关重要的。常用的polyA尾是?bp，但不同的细胞可能有不同的偏好。

例如，人单核细胞来源的DC中polyA尾的最佳长度为-个核苷酸，人原代T细胞中polyA尾的最佳长度为个核苷酸。此外，polyA结合蛋白（polyAbindingprotein，PABP）可通过翻译起始因子（如eIF4G和eIF4E）与5cap相互作用，形成一个影响mRNA结构的闭环。Lima及其同事最近的研究发现，较短的poly（A）序列可以促进这种闭环结构的有效翻译。

05

核苷修饰的mRNA

另一种提高mRNA稳定性、翻译效率和mRNA疫苗效力的方法是用替代核苷酸修饰的mRNA。假尿苷(Ψ),1-甲基假尿苷（m1Ψ),和5-甲基胞苷（m5C）用于取代天然尿苷和胞苷，从而去除PKR和RIG-I的细胞内信号传导触发，增强抗原表达。Kariko等人发现改变mRNA结构中的核苷（例如5mC或Ψ)可以显着降低先天免疫激活并增加mRNA的翻译能力。

转录后表观基因组RNA修饰也是改善mRNA翻译和逃避先天免疫应答的有效方法。Arango及其同事报道，用N4-乙酰胞苷（N4-aceylcytidine，ac4C）进行转录后RNA修饰可增强体外和体内mRNA的翻译。此外，有研究发现RNA甲基转移酶mettl3介导mRNAm6A甲基化并诱导DC活化。

06

IVT-mRNA的纯化

如第二节所述，IVT中的噬菌体聚合酶可产生多种污染物，包括由失败转录起始事件产生的短RNA和由自身互补3延伸产生的dsRNA。这些RNA污染物可以激活细胞内PPR，包括PKR，MDA-5，OAS等，并导致mRNA翻译的停止和先天免疫的激活。Kariko及其同事已经证明，去除这些RNA污染物会阻止mRNA诱导IFN和炎性细胞因子，最终导致人类原代DC中蛋白质产量增加10到0倍。

通过降低Mg2+浓度或在高温下产生RNA，可以在IVT期间减少dsRNA。通过高压液相色谱（HPLC）进行更完整的dsRNA去除。然而，高效液相色谱法纯化mRNA通常成本高，产量低(?50%)。最近，Baiersdorfer等人报道了一种快速廉价的纯化方法。该方法利用dsRNA与含乙醇缓冲液中纤维素粉末的选择性结合并且搭配快速蛋白质液相色谱（FPLC）去除高达90%的dsRNA。完全去除dsRNA污染物的另一种方法是通过mRNA的固相合成而不是IVT。例如，Shivalingam等使用固相法合成了70个核苷酸的RNA片段，然后将RNA片段连接成全长mRNA。这个过程是可扩展的，完全避免了dsRNA的形成。

07

利用IFN-1改善mRNA疫苗接种

如第三节所述，IFN-1对mRNA肿瘤疫苗的免疫应答显示出矛盾的影响。一些研究表明，由mRNA和递送系统修饰所致的先天免疫刺激对于增加免疫原性不是必需的。其他研究表明，mRNA疫苗需要通过与佐剂组合来增强免疫应答，以实现靶向抗肿瘤治疗结果并改善患者的存活率。

Islam及其同事报道了用棕榈酸修饰的TLR7/8激动剂R脉冲的mRNA显着改善了APC中OVAmRNA衍生抗原的MHCI类呈递，与没有佐剂的mRNA疫苗相比随后在荷瘤小鼠模型中诱导了更有效的适应性免疫应答。由CureVacAG开发的疫苗平台RNActive?使用RNA/鱼精蛋白复合物作为佐剂激活TLR7/8，诱导Th1T细胞应答。

当用裸露的、未修饰的编码抗原的mRNA搭配鱼精蛋白佐剂时，实现了增强的抗肿瘤免疫力。除了使用TLR激动剂作为佐剂之外，干扰素基因（stimulatorofinterferongenes，STING）激动剂最近已作为免疫调节剂同时与mRNA和肽疫苗组合使用。Miao等人已经证明，将mRNA癌症疫苗加载到具有内在STING-IFN激活功能的LNP中产生了有效且延长的CD8+T细胞应答。在添加STING活化脂质的三种癌症模型中观察到改善的抗肿瘤功效。

最近，在临床前和临床研究中，还开发了促炎细胞因子和趋化因子的组合来增强mRNA疫苗的抗肿瘤免疫力。在一项临床研究中，将由TAA混合物组成的基于DC的mRNA疫苗接种与用编码CD70，CD40配体（CD40L）和组成型活性TLR4（TriMix）的mRNA电穿孔的DC一起施用。共刺激分子CD70和CD40L与活性TLR4一起在DC的激活和CD8+T细胞应答的启动中起关键作用。

细胞因子混合物不仅用于引发DC和T细胞功能，还可以肿瘤内给药以重塑肿瘤微环境。例如，瘤内注射编码细胞因子IL-23，IL-36?的mRNA。T细胞共刺激OX40L可以克服抑制性肿瘤环境，产生有效的全身抗肿瘤免疫。

佐剂与mRNA疫苗组合的研究正在兴起，但应谨慎使用该策略，因为它可能适得其反且自相矛盾，特别是当使用与IFN-1和先天免疫途径具有紧密相互作用的免疫刺激分子时。

五、自扩增mRNA疫苗的结构、优势和递送

有望最大限度地提高抗原序列长度和产量的RNA疫苗是自扩增mRNA（selfamplicationmRNA，SAM）。SAM来源于正单链RNA病毒（+ssRNAvirus），最常见的是来自alphaviruses如SindbisandSemliki-Forestviruses。能够形成感染性病毒颗粒的alphaviruses结构蛋白编码基因已经被编码靶抗原的基因取代，而其RNA复制机制仍然存在。

具体而言，保留病毒RNA依赖性RNA聚合酶（称为复制酶）和非结构蛋白组装成多复制酶复合物以指导RNA的在细胞质内扩增，如图2所示。SAM可以随着时间的推移自我扩增（最多2?个月），因此由于病毒复制机制的完整性而诱导更有效和持久的免疫应答。之所以SAM平台优于其他非复制型mRNA疫苗，是因为其允许在较长时间内从很低剂量疫苗接种中产生大量抗原。Johanning等报道，相较于非复制mRNA，肌肉注射Sindbis病毒衍生的SAM导致抗原表达率增加10倍，表达延长8天（从2天增加到10天）。

图2.常规mRNA和SAM的比较

SAM的早期研究是直接注射包装在病毒复制颗粒（viralreplicationparticles，VRP）中的SAM。VRP是小鼠、非人灵长类动物和人类的有效疫苗。然而，复制性的VRP结构蛋白可能诱导非特异性免疫原性和毒性。为了减少病毒组分的感染性问题，产生了繁殖缺陷型VRP。修饰后VRP的衣壳和包膜蛋白使用反式编码形成有缺陷的辅助构建体。进入靶细胞质后只有RNA可以进一步扩增，而VRP的其他部分缺乏形成感染性病毒颗粒的能力。如今，IVT后产生的完整合成SAM可以直接用作mRNA疫苗，消除了病毒组分的潜在安全性问题。

因为SAM是一个巨大的带负电荷的分子(~??nt），需要递送系统来实现其有效的细胞摄取并防止酶降解。

在过去的几年中，研究人员已经做出了巨大的努力来确定适用于IVTSAM的递送载体。Vogel等人采用中等长度的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）来递送长SAM，结果显示SAM的剂量减少了64倍，达到了与非复制mRNA相当的免疫力。

为了降低不可降解阳离子聚合物的潜在毒性，开发了一种称为“pABOL”的生物可还原线性阳离子聚合物来递送SAM。Blakney等人证明pABOL通过肌内（i.m.）和皮内（i.d.）注射增强蛋白质表达。Geall及其同事提出了一种新的疫苗平台，该平台基于封装在合成LNP中的自扩增RNA。LNP平台保护SAM免于酶促降解，允许在i.m.注射后有效的基因递送，并且在呼吸道合胞病毒（RSV）感染模型中进行了概念验证。

Manara报道了将表达GM-CSF的RNA与SAM共同施用以提高针对小鼠中致死性流感病毒攻击的效力。此外，Lou等人和Anderluzzi等人都评估了不同的阳离子脂质制剂，包括脂质体、LNP、聚合物纳米颗粒和乳液，以包封狂犬病病毒糖蛋白G（SAM-RVG），并发现含有DOTAP的聚合物纳米粒子和LNPs在引发体液和细胞免疫方面最有效。

最后，SAM被截断为两个转录本，以解决递送效率低下的问题。Beissert及其同事已将编码目标抗原的SAM与复制酶活性分开，使用共转染的反式RNA提供复制酶活性。这两个分开的SAM表现出比其对应的全套单个SAM高10-倍表达。使用该平台技术的流感血凝素抗原编码RNA的剂量低至50?ng即可诱导中和抗体。

同时使用VRP和LNP的SAM体系在预防传染病方面的临床应用是有希望的。然而，SAM在癌症疫苗中的应用主要限于临床前研究，仅有两项临床试验（NCT和NCT）正在使用VRP治疗针对结肠直肠癌的抗原。SAM的临床和免疫学益处仍在争论中，限制SAM应用的一个主要考虑因素是内在的PAMP性质，这使得难以调节炎症表征，可能限制重复给药的抗肿瘤治疗。

mRNA肿瘤疫苗技术路线是所有肿瘤疫苗路线中最有前景的，本文已经介绍了mRNA肿瘤疫苗中使用的mRNA，包括复制mRNA（SAM）序列自身的一些理化特性、药理学和优缺点及优化方向，下篇将详细介绍mRNA递送技术和相关的在研临床试验，敬请期待。

作者简介

费才溢，开心生活科技（HLT）创新中心核酸药物开发负责人，中国科学技术大学生物信息学博士毕业，多年精准医疗项目开发经验，对mRNA技术路线药物开发有深刻见解。